In der Glykolyse durchläuft Glucose eine Reihe von enzymatischen Reaktionen. NAD+ kommt ins Spiel, um Wasserstoffatome (Protonen und Elektronen) von bestimmten Zwischenprodukten zu übernehmen. Diese spezifische Aktion findet im Schritt der Umwandlung von Glyceraldehyd-3-phosphat (G3P) zu 1,3-Bisphosphoglycerat statt. Hier agiert NAD+ als Elektronenakzeptor und wird zu NADH reduziert. Dieser Vorgang ist entscheidend, da er nicht nur hilft, Energie zu konservieren, die später in der Elektronentransportkette genutzt wird, sondern auch dafür sorgt, dass die Glykolyse kontinuierlich ablaufen kann. Ohne die Regeneration von NAD+ würde der Prozess zum Stillstand kommen, da das verfügbare NAD+ aufgebraucht wäre.